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今天來說說色譜柱的“沐浴”與“再生”之術

發布時間:2019-12-25        內容來源:月旭科技

各位小伙伴了解月旭色譜柱的維護方法嗎?總是有小伙伴用錯了沖洗方式,在這里介紹一些反相色譜柱沖洗和再生的實用方法,希望不太了解的小伙伴們快來看一看。


壹·反相色譜介紹

迄今為止,反相色譜是高效液相色譜中使用最廣泛的技術,它能普及的原因是其能適用于絕大多數非極性化合物、弱極性化合物及離子化合物的分析。反相色譜中使用的固定相大多是天然存在的疏水基團,由于待測物與固定相之間相互作用的不同而被分離開來。


貳·反相色譜柱是如何被污染的

反相色譜柱中使用最多的就是硅膠基質色譜柱。硅膠基質的表面有許多殘留的硅醇基,圖1顯示了硅醇基可能存在的多種形式。在弱酸性環境中,這些硅醇基能和特定的化合物和基質成分特別是堿性化合物發生相互作用,導致堿性化合物吸附于硅膠表面。同時,硅膠中殘留的重金屬離子會將酸性更強的物質引入到硅膠表面中。另外,硅膠也會與金屬螯合物或清潔劑發生相互作用。


圖1、硅醇基存在狀態


例如,像玉米油,高級芳香化合物和蠟這樣的樣品基質會粘附在反相填料表面并改變其性質,含有蛋白質成分的生物樣品也會吸附在填料顆粒表面,即使采用樣品前處理的方法來避免外來物質的污染以保護色譜柱,最終待測物的基質仍然會吸附在色譜柱表面。色譜柱在被污染后的色譜行為會不同于未被污染的色譜柱。


通常樣品基質中會含有一些與目標分析物無關的污染物。比如鹽,酯類,脂肪族化合物,有機酸,疏水性蛋白和其他生物組分,這些都是可能與固定相發生相互作用的物質。與目標分析物相比,這些污染物的保留能力可能更強。一旦這些預料之外的污染物被檢測器檢測到,在色譜圖上則表現為色譜峰分叉,基線波動甚至是負峰。


如果污染物在色譜柱上的保留能力很強,流動相的洗脫能力不足以將這些污染物沖出來,那么在多次進樣后,這些吸附在色譜柱上的污染物就會聚集。當污染物積累足夠多時,它們就會像改性填料一樣表現出相應的性質,目標分析物與這些污染物的相互作用會影響其原本的分離機制,導致保留時間波動和峰拖尾。如果污染物更多,則柱壓可能升至很高的水平,甚至超過柱壓上限。


叁·沖洗反相色譜柱

月旭色譜柱推薦正向使用,反向沖洗。


由于絕大多數保留能力強的污染物通常位于色譜柱柱頭端,因此反沖色譜柱可以大大縮短污染物離開色譜柱需經過的距離。月旭色譜柱兩端所用篩板孔徑一致,不會出現反沖時將填料沖出的問題。大多數現代不銹鋼色譜柱是在比日常使用壓力更高的壓力條件下充填的,因此在反沖時柱床通常不會受到影響。


對反相柱進行柱清洗的頻率取決于強保留性物質進入到色譜柱的多少。由于反相色譜柱在表現出分離度下降或釋放異常物質之前能夠耐受較大程度的污染,因此用戶通常等觀察到色譜柱異常后才會進行沖洗,但是污染物的堆積會使清洗工作變得更為困難。基于這個原因,如果有的樣品基質比較復雜,建議定期對色譜柱進行沖洗。對色譜柱沖洗的頻率越高,所需的沖洗程序也就越簡單。


NO.1

日常沖洗


NO.2

異常沖洗

(當色譜柱出現柱壓升高、峰型異常、柱效下降、分離度下降)


肆·沖洗反相色譜柱的殘留蛋白質

如果污染物是生物類,比如血漿,血清,蛋白質和多肽在反相色譜柱上聚集,通常乙腈或甲醇這樣的純有機溶劑難以溶解這些污染物。然而,有機溶劑與緩沖鹽、酸或者離子對試劑混合溶劑能沖洗掉生物類污染物。


如果色譜柱被生物類樣品污染,推薦使用乙腈:水:三氟乙酸 (50/50/0.1)為流動相,在做樣流速下反向沖洗60倍柱體積,并在進樣前用初始流動相對色譜柱進行平衡,那么色譜柱對生物類樣品的分離能力就可以恢復


各位小伙伴如果想了解更多有關高效液相色譜柱的清洗與再生的相關信息,請咨詢月旭當地銷售人員或撥打400-810-6969垂詢。


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